|
|
Stanovení aktivity průmyslově významných enzymů produkovaných mikroorganismy izolovanými z potravinového odpadu
Lymarenko, Sofiia
Při zpracování potravinového odpadu hraje důležitou roli mikrobiom a enzymy, které produkuje. Bacillus licheniformis je jedním ze zástupců mikroflóry při kompostování a zdrojem průmyslově významných hydrolytických enzymů: proteas, lipas a celulas. V rámci diplomové práce byla stanovována enzymatická aktivita pomocí spektrofotometrických metod u sedmi kmenů B. licheniformis izolovaných z potravinového odpadu po dobu 96 až 192 hodin. U všech sedmi kmenů byla prokázána celulasová, proteasová a lipasová aktivita, což se shoduje s dosud publikovanou literaturou. Nejvyšší celulasová aktivita stanovena dvěmi metodami byla zaznamenána u kmene 3A-52 (1 U/ml) a 1A-52 (1,5 U/ml) po 24 hodinách kultivace. pH optimum pro celulasovou aktivitu bylo 7, a teplotní optimum 50 °C až 60 °C. Maximální proteasová aktivita byla detekována později až po 120 a 144 hodinách kultivace u dvou kmenů: 3A-52 (1,3 U/ml) a 3D-42 (1,4 U/ml). Při provedení optimalizace se zjistilo, že pH optimum bylo 9 až 11 a teplotní optimum 40 až 45 °C v závislosti na kmenu. Maximální lipasová aktivita byla přibližně 0,7 U/ml a to po 144 hodinách kultivace u 4D-41 a 3D-42. Teplotní optimum bylo zjištěno při 50 až 60 °C a rozmezí pH optima pro tuto aktivitu bylo velice široké v závislosti na studovaném kmenu. U kmenů s nejvyšší enzymatickou aktivitou byla stanovená růstová křivka, kde nejvyšší celulasová aktivita odpovídala době přechodu bakteriální kultury z exponenciální fáze do stacionární, a nejvyšší lipasová a proteasová aktivita byla zjištěna později až při přechodu ze stacionární fáze do fáze odumírání. Kmeny 3A-52 a 3D-42 vykazovaly nejvyšší aktivitu u všech tří sledovaných enzymů. Následně tyto kmeny izolované při kompostování by mohly být použity pro produkci enzymů v průmyslu.
|
|
|
Synthesa peptidů jako potenciálních ligandů aspartátové proteázy HIV a MAY1 a ověření jejich inhibiční aktivity
Klikarová, Ivana ; Šácha, Pavel (vedoucí práce) ; Žáková, Lenka (oponent)
Virus lidské imunodeficience (HIV) je lentivirus, součást čeledi Retroviridae, přenosný krví a jinými tělesnými tekutinami. Nepřetržitá replikace HIV v lidském těle vede k destrukci klíčových imunitních efektorových buňek, lymfocytů CD4. Postupem času vede pokles CD4 lymfocytů k oportunním infekcím, které definují syndrom získané imunodeficience (AIDS). Potřeba nových tříd antiretrovirových léků se stala aktuální kvůli rostoucím obavám z dlouhodobých toxických účinků stávajících léků, potřebě bojovat proti variantám HIV-1, které jsou rezistentní vůči léčbě, a četnosti změn léčby u pacientů, kteří již nějaké léky užívali. V současnosti je vývoj léků zaměřen na inhibitory dvou virových enzymů - reverzní transkriptázy a proteázy. Antiretrovirová terapie používá inhibitory proteázy v kombinaci s nukleosidovými analogy způsobující účinnou a trvalou supresi virové replikace, snížení morbidity a prodlužování života pacientů s infekcí HIV. Infekce způsobené Cryptococcus neoformans a Cryptococcus gattii postihují převážně imunokompromitovanou populaci a vyznačují se vysokou morbiditou a mortalitou. Tato populace zahrnuje jedince infikované HIV a osoby podstupující transplantaci orgánů, stejně jako zdánlivě imunokompetentní pacienty. V posledních letech vzniká na běžně používaná antimykotika rezistence,...
|
|
|
Vývoj, složení a funkce žlázového aparátu cerkárií schistosom a endopeptidázy v jeho obsahu
Titlová, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Konečný, Lukáš (oponent)
Motolice čeledi Schistosomatidae jsou krevní parazité s dvouhostitelskými životními cykly zahrnujícími vodní plže jako mezihostitele a definitivní hostitele z řad ptáků či savců. Cerkárie jakožto invazivní vodní stádia schistosom se do lumen cév dostávají penetrací kůže definitivního hostitele. V průběhu svého krátkého života disponují cerkárie žlázovým aparátem sestávajícím ze tří typů žláz s vnější sekrecí: penetračních žláz, únikových žláz a hlavové žlázy. Tyto žlázy vylučují sekretorická granula obsahující mimo jiné proteolytické enzymy, které hrají důležitou roli v procesu penetrace kůže hostitele, ale zároveň zaujímají mnoho dalších funkcí v průběhu života cerkárie i dalších životních stádií schistosom. Tato práce shrnuje základní poznatky o anatomii, funkci a vývoji žlázového aparátu cerkárií schistosom a dále se zaměřuje na zastoupení proteolytických enzymů v těchto žlázách, konkrétně endopeptidáz. Na závěr stručně porovnává rozdílné zastoupení endopeptidáz u různých zástupců čeledi.
|
|
|
Study of the substrate specificity of the LACTB tumour suppressor enzyme
Baudyšová, Alžběta ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent)
Mitochondriální beta-laktamasa (LACTB) je nádorový supresor, jehož exprese způsobuje změny v metabolismu mitochondriálních fosfolipidů a indukuje diferenciaci nádorových buněk v buňky nerakovinné. Tento jev je způsoben down regulací fosfatidylserin dekaboxylasy (PISD), což následně vede ke snížení množství fosfatidyletanolaminů a lysofosfatidyletanolaminů v membráně mitochondrie. PISD ale není LACTB přímo štěpeno a tedy otázka, co je fyziologickým substrátem LACTB, zůstává stále nezodpovězená. Abychom se pokusili zaplnit tuto mezeru v našem poznání o mechanismech a funkci nádorového supresoru LACTB, byla tato diplomová práce zaměřena na nalezení substrátu LACTB pomocí proteomické analýzy PICS. Aby mohla být analýza provedena, bylo třeba nejprve vyizolovat rekombinantní wild-type LACTB a také LACTB se zrušeným katalytickým místem, zjistit, jaké je ideální in vitro prostředí pro práci s rekombinantním LACTB a také jaké podmínky jsou nutné pro to, aby LACTB tvořila multimery. Mé výsledky ukázaly, že aktivita LACTB in vitro stoupá se zvyšujícím se pH a také po přidání vápníku. Také jsem ukázala, že monomery LACTB v multimerních formách jsou spojeny disulfidickými můstky a že se tyto multimery rozpadají po přidání dithiothreitolu. Nejzajímavějším výsledkem práce byl poznatek, že LACTB je svým vlastním...
|
|
|
Proteasa Sapp3p patogenní kvasinky Candida parapsilosis
Sochor, Richard ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Zábranská, Helena (oponent)
Patogenní kvasinky rodu Candida mohou způsobovat systémová onemocnění, která mohou u pacientů trpících imunosupresí v důsledku nějakého onemocnění, jako je například onemocnění AIDS, způsobovat závažné patologické stavy, které mohou vést až k úmrtí pacienta. Jednou takovou kvasinkou je patogenní kvasinka Candida parapsilosis. Pro kolonizaci hostitelských tkání a průniku do organismu využívá tato kvasinka různou škálu virulentních faktorů. Jedním z těchto virulentních faktorů jsou aspartátové proteasy. V patogenní kvasince C. parapsilosis se nachází tři aspartátové proteasy Sapp1p, Sapp2p a Sapp3p, které jsou paralogy. První dvě aspartátové proteasy jsou zodpovědné za zvýšení virulence kvasinky C. parapsilosis. Napomáhají kvasince přežívat v organismu degradací důležitých složek imunitního systému hostitele. Sapp3p ovšem tyto vlastnosti nevykazuje, kromě toho, že v určité míře napomáhá kvasince k adhezi na abiotické povrchy. Tato práce je zaměřena na objasnění funkce a lokalizace Sapp3p v kvasince C. parapsilosis. Pro objasnění funkce byl rekombinantně připraven prekurzor Sapp3p (pro- Sapp3p) v buňkách E. coli. U takto připraveného proteinu byla dále testována jeho autokatalytická aktivace a asistovaná aktivace pomocí trypsinu a Kex2p proteasy, za různých podmínek. Za zvolených podmínek se...
|
|
|
Role WSS1 proteasy v DNA reparačních procesech kvasinkové buňky.
Adámek, Michael ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Zachování integrity DNA je v průběhu života kritické pro každý živý organismus. Organismy si proto vyvinuly mnoho způsobů, jak detekovat a opravit různé typy poškození DNA, způsobené endogenními i exogenními vlivy, vyúsťující dále v replikační stres. Chyby v těchto opravných mechanismech mohou vést k závažným lidským onemocněním, jako jsou neurologické poruchy, familiární druhy onkologických onemocnění nebo vývojové syndromy. V této diplomové práci byla zkoumána funkce kvasinkového proteinu Wss1, metaloproteasy, která se podílí na nedávno objevené DNA opravné dráze, která proteolyticky odstraňuje proteiny kovalentně zachycené na zuje silnou negativní interakci s jinou proteasou opravující DNA, Ddi1, přičemž bylo objeveno, že kvasinkový kmen postrádající současně geny je hypersenzitivní na hydroxyureu. Hydroxyurea inhibuje ribonukleotidreduktasu, čímž v konečném důsledk způsobuje zastavení buňky v fázi buněčného cyklu. V rámci této diplomové práce byly na základě předchozích studií provedeny tzv. "rescue" experimenty s různými variantami Wss1, postrádajícími jednotlivé domény či obsahujícími bodové aminokyselinové záměny. Tyto experimenty následně posloužily k posouzení účasti jednotlivých domén proteinu Wss1 v odpovědi na replikační stres vyvolaný hydroxymočovinou.
|
|
|
Příprava rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní
Illichová, Hana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu v oblastech tropů a subtropů. Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je trávicí cysteinová proteasa krevniček, která se svou dipeptidylaminopeptidasovou aktivitou účastní degradace hemoglobinu z krve hostitele. Tento enzym je pro metabolismus krevniček nezbytný a představuje potenciální molekulární cíl pro vývoj chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Kathepsin C krevniček nebyl dosud detailně studován a bakalářská práce se soustředí na vývoj expresních systémů pro produkci rekombinantního kathepsinu C ze Schistosoma mansoni (SmCC). V kvasinkách Pichia pastoris byl SmCC exprimován ve formě inaktivního prekurzoru (zymogenu) a byla analyzována jeho proteolytická stabilita. Dále byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae, pro který byly navrženy čtyři odlišné konstrukty umožňující optimalizovat produkci SmCC.
|
|
|
Cathepsins L of Diplostomum pseudospathaceum cercariae
Perháčová, Terézia ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Hartmann, David (oponent)
Táto štúdia sa zaoberá cysteínovými peptidázami cerkárií motolice Diplostomum pseudospataceum. Naväzuje na doterajší výskum, ktorý u cerkárií biochemicky a hmotnostnou spektrometriou potvrdil prítomnosť cysteínovej peptidázy o veľkosti približne 24 kDa a postuloval jej histolytickú funkciu pri penetrácií tkanív cerkáriami. Pri pokuse o purifikáciu danej peptidázy a charakterizáciu jej peptidolytickej aktivity bolo zistené, že v homogenáte cerkárií sa nachádza viac rôznych cysteínových peptidáz, líšiacich sa ich pI. Podľa peptidolytickej aktivity a testov jej inhibície ide o cathepsin L- like peptidázy, so širokým spektrom pH v ktorom sú aktívne a optimom aktivity pri slabo kyslom až neutálnom pH. Pomocou degenerovaných primerov vytvorených na základe konzervovaných miest cysteínových peptidázbola získaná čiastočná sekvencia troch génov pre katepsíny L D. pseudospathaceum (DpCL1, 2 a 3). Následne boli získané kompletné sekvencie génov DpCL2 a 3 a čiastočná sekvencia bez 5' konca DpCL1 pomocou RACE PCR. Pre potvrdenie funkcie daných peptidáz bol uskutočnený pokus imunolokalizovať ich. Predpoklad bol, že sa nachádzajú v penetračných žľazách. Preliminárne výsledky naznačujú, že by sa niektoré z katepsínov mohli nachádzať tiež v črevách cerkárií. Pre detailnejšiu biochemickú charakterizáciu a...
|
|
|
Cathepsin L by parasites - occurrence, features, functions
Perháčová, Terézia ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent)
Katepsíny L sú lyzozomálne cysteínové endopeptidázy so všeobecnou funkciou katabolizmu proteínov. Táto práca pojednáva o doterajších poznatkoch o vlastnostiach katepsínov L, v korelácií s ich špecifickými funkciami u parazitov. Detailnejšie popisované sú črty a funkčné rozdiely vybraných katepsínov L s ich objasnením na molekulárnej úrovni. Dôraz kladie na biochemické vlastnosti s následným vyvodením uplatnenia týchto enzýmov. Jednotlivé kapitoly sú venované kinetoplastidovým katepsínom L, katepsínom L apikomplex, entaméb a helmintov, ktorá je prevažne venovaná katepsínom Fasciola spp a Schistosoma spp. Kľúčové slová hydroláza, proteáza, cysteínová peptidáza, cathepsin L, katepsín L, lyzozóm, parazit
|
|
|
Nestrukturní proteiny virů Zika a Dengue s enzymovou aktivitou.
Krýsová, Eliška ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Viry Zika a Dengue kódují vlastní enzymy, které jsou aktivní v různých stádiích replikačního cyklu. NS3, NS5 protein a jejich kofaktory hrají nepostradatelnou roli ve fungování flavivirů. I když byly struktury těchto proteinů již vyřešeny, jejich vlastnosti jsou prozkoumány jen částečně a mnoho aspektů ohledně jejich funkce zůstává nevyřešeno. Hlavními tématy této práce je úloha NS3 a NS5 proteinu v životním cyklu virů Zika a Dengue, sestřih polyproteinového prekurzoru, samotná replikace a interakce těchto enzymů s dalšími strukturními a nestrukturními proteiny. NS3 a NS5 protein mají mnoho enzymatických aktivit strukturně i funkčně oddělených, což je činí zajímavými z hlediska výzkumu autoaktivace, interakce funkčních domén a proteinů mezi sebou. Jelikož jsou infekce viry Zika a Dengue stále velmi vážným problémem, je nezbytné co nejlépe pochopit molekulární mechanismy jejich replikace. Klíčová slova: proteasa, polymerasa, Zika, Dengue, sestřih polyproteinů, protivirová terapie
|
host ::
RSS.